J Neurosci︱深圳先进院刘畅课题组揭示果蝇椭球体环状神经元亚型在睡眠调控中的特异性作用

撰文︱闫   薇

责辑︱王思珍，方以一

编辑︱王思珍

睡眠在许多生理功能中发挥关键作用，而大脑中的睡眠调控是个十分复杂的过程，从分子、细胞、环路及网络水平层次上进行调控[1-5]。与哺乳动物相比，果蝇作为研究睡眠的模型具有脊椎动物睡眠的大多数高度保守特征，且中枢神经小巧，具备强大的遗传工具。果蝇大脑的椭球体（ellipsoid body，EB）作为信息处理和整合中心，调节多种复杂行为，包括空间定向、导航、觉醒、睡眠等[6-12]。椭球体的构成也表现出复杂性，目前研究鉴定出22类神经元亚型[13]，它们的轴突以环状形态投射到椭球体同心层中，存在高水平的解剖学连结性和功能异质性，能够实时协同调控睡眠。以往的研究中发现椭球体R2、R3、R4d和R4m亚型可以适应视觉刺激，这种感觉输入可能是改变睡眠/觉醒状态的一个重要线索，并且很可能受到昼夜节律系统的影响[10, 11, 14, 15]；R5亚型与睡眠稳态控制和睡眠结构的稳定有关[5, 16]；5HT7-GAL4标记的神经元在睡眠维持中发挥重要作用，当被激活时，睡眠变得碎片化[17]。另外最近发布的一项研究确定了R3m神经元促进睡眠，R3d神经元促进清醒[18]。以往的研究在描述椭球体环状神经元不同亚型的形态和解剖学连结性方面取得了系列进展，但睡眠调节的细胞亚型特异性在很大程度上是未知的。

2022年12月19日，中国科学院深圳先进技术研究院的刘畅团队与布兰迪斯大学的Leslie C. Griffith团队合作在 the Journal of Neuroscience上以长文形式发表了题为“Subtype-specific roles of ellipsoid body ring neurons in sleep regulation in Drosophila”的文章，鉴定出果蝇中央脑椭球体中几类环状神经元亚型以协同方式影响睡眠的稳态和结构，有助于揭示大脑中编码和整合的规则。中国科学院深圳先进技术研究院刘畅团队的研究助理闫薇为文章第一作者，刘畅研究员和Leslie C. Griffith教授为文章的共同通讯作者。

在果蝇中，多种神经细胞类型/环路参与睡眠总量、结构以及稳态的调节，但对椭球体调控睡眠的理解仍然有限。因椭球体结构及其连接方式的特殊性，鉴定构成椭球体的特定亚型细胞的功能，可以为理解它们如何协同调控睡眠提供突破口。研究团队利用现有的果蝇品系资源库，搜集了34个标记椭球体环状神经元的品系，利用热遗传工具dTripA1[19]，激活不同类型的椭球体环状神经元，同时记录果蝇的睡眠行为表征，通过分析睡眠总量、觉醒次数、睡眠片段长度以及清醒到睡眠（P(doze)）、睡眠到清醒（P(wake)）的可能性，筛选出对睡眠总量以及睡眠结构产生影响的椭球体环状神经元品系（图1）。结果可见激活椭球体环状神经元对睡眠总量、结构以及稳态产生复杂的影响。同时，在标记果蝇椭球体环状神经元的品系中表达绿色荧光蛋白，利用免疫组化的方法，通过解剖学的分析，鉴定所标记的椭球体环状神经元亚型。

图1 日间睡眠随着环状神经元亚型的激活而变化

（图源：Yan Wei, et al., J Neurosci, 2022）

由于这些果蝇品系标记多种椭球体环状神经元亚型，很难简单地将椭球体环状神经元的单一亚型与调节睡眠量/结构的特定功能联系起来。为了识别椭球体环状神经元亚型和睡眠表型之间的联系，研究团队采用数学计算方法来评估每个亚型的重要性。

首先，团队成员利用混合高斯模型的方法对睡眠压力P(doze)和睡眠深度P(wake) [20] 进行聚类分析，通过对空间分布上睡眠深度和压力有类似影响的品系加以聚类，鉴定出调控睡眠的5个群组，且在白天和夜晚调控功能的动态变化趋势（图2）。进一步对这些群组的椭球体环状神经元亚型的分析，发现每个群组中可汇聚出协同发挥功能的环状神经元亚型。在白天（图2A），R4m具有较高的P(wake)值，强有力地调节睡眠深度/觉醒；R3dm呈现出强的睡眠驱动力，增加入睡的可能性。尽管R2/R3dp神经元在白天没有出现对睡眠深度和驱动有独特的功能，但夜晚显示出其促醒的功能（图2B）。在夜晚，R3amp亚型（以R47F07-GAL4品系为代表）促醒的趋势较白天更为显著，而不同的R4m分别增强了睡眠压力（以R70B05-GAL4品系为代表）或者降低了睡眠深度（以Feb170-GAL4品系为代表）（图2B）。

图2 睡眠深度和睡眠压力的变化与椭球体环形神经元亚型之间的关联

（图源：Yan Wei, et al., J Neurosci, 2022）

由于使用混合高斯模型聚类分析的变量是GAL4果蝇品系，通常是环状神经元亚型的组合，观察到的影响也可能是特定亚型组合的结果，而不是单一亚型的结果。为区分特定亚型的效应，研究团队采用了第二种数学方法一般线性模型（GLM）开展分析，以环状神经元亚型为变量，分别计算每个亚型对白天和夜间所有睡眠参数的潜在贡献的权重。最终抽提出两类具有特定功能的椭球体环状神经元亚型：R3p和R4m，前者通过调控睡眠片段时长而影响日间睡眠总量（图3A-B），后者调控夜间睡眠（图3C-D），这个结果支持并扩展了高斯模型的发现。

图3 通过一般线性模型识别并鉴定两类环状神经元亚型的功能

（图源：Yan Wei, et al., J Neurosci, 2022）

在品系筛选过程中团队发现有的品系参与调节睡眠结构但不影响睡眠量。这些数据与团队之前的研究一致：椭球体中的5HT7-GAL4神经元是睡眠结构的调节器；激活5HT7-GAL4神经元可以在不改变睡眠量的情况下导致睡眠碎片化[17]。根据最近的解剖分析[13]，5HT7-GAL4标记的神经元包括R3d、R3p和R4d亚型。为了研究睡眠结构调控是否可以归因于特定的亚型，团队发现一个果蝇品系R44D11-LexA，其表达模式类似于5HT7-GAL4，二者神经元重叠近79%，但R44D11-LexA标记的神经元在激活时不会引起睡眠/结构的变化。为了检测R44D11-LexA和5HT7-GAL4标记的非重叠的神经元类型是导致睡眠碎片化的假设，引入遗传学工具LexAop-GAL80来沉默R44D11-LexA和5HT7-GAL4标记的重叠神经元的表达。结果显示非重叠的神经元的激活增加了觉醒次数，减少了睡眠片段长度（图4B），表明非重叠神经元（形态学上为R3d）（图4A）在睡眠碎片化中起着关键作用，最终团队将睡眠碎片效应细化到特定的神经元亚型R3d。

图4 R3d神经元导致睡眠碎片化

（图源：Yan Wei, et al., J Neurosci, 2022）

图5 环神经元多种亚型参与睡眠/结构调控的示意图

（图源：Yan Wei, et al., J Neurosci, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究系统研究了椭球体环状神经元对睡眠总量、睡眠结构和睡眠稳态的调控特征，以及激活时对睡眠压力和/或深度的影响；进一步结合数学模型（混合高斯模型和一般线性模型）以及遗传学操作手段鉴定几类椭球体环状神经元亚型在睡眠调控中的特异功能（图5），为理解特定脑区在睡眠调控中的编码特征提供了重要基础。未来，研究团队还需要付出更多的努力来探究单一亚型的环状神经元是如何对感觉输入做出反应的，神经元的活动模式是如何在神经元网络中发挥功能的，以及不同环状神经元亚型的功能与其他行为是如何相互作用的。以椭球体这个局域脑区作为抓手，为探究大脑如何编码和整合睡眠以及其他行为的基本原理将提供新的思路和契机。

原文链接：https://doi.org/10.1523/JNEUROSCi.1350-22.2022

---

欢迎扫码加入逻辑神经科学 文献学习2

群备注格式：姓名-单位-研究领域-学位/职称/称号/职位
往期文章精选【1】Adv Sci︱郑瑞茂团队揭示下丘脑RIIβ蛋白激酶A（RIIβ-PKA）调控脂肪组织褐变新机制
【2】PLoS Biol︱想要聪明又长寿，充足睡眠很重要，黄胜/朴成姬等揭示突触前活性区可塑性协调长寿、睡眠和记忆中的重要作用【3】Psychiatry Clin Neurosci︱周婷婷/伍建林课题组运用羧酸组学发现抑郁症代谢异常及可能的诊断标志物【4】iScience︱研究毒品可卡因产生兴奋和成瘾机制的新工具：潘平越课题组开发出监测神经元上多巴胺转运体动态时空分布的强大工具【5】Front Mol Neurosci︱湖北科技学院医学部朱海丽团队揭示骨癌痛大鼠脊髓组织蛋白质组学变化
【6】综述文章推荐专题第二期︱Cell期刊神经科学领域最新前沿综述精选（2022年10月-11日）【7】Brain Stimul︱汪凯课题组揭示了经颅交流电刺激可改善卒中后失语患者的语言理解能力
【8】Cell Reports︱“阻止癫痫点燃的湿火柴”，陈忠/汪仪团队解析癫痫发作间期治疗意义【9】EMBO J︱何凯雯课题组发现皮层中小清蛋白阳性PV神经元功能受时间和睡眠调控【10】Aging Cell |杜怡峰团队揭示长期有氧运动对抗阿尔茨海默病记忆下降的新机制NeuroAI 读书会【1】NeuroAI 读书会启动︱探索神经科学与人工智能的前沿交叉领域
优质科研培训课程推荐【1】膜片钳与光遗传及钙成像技术研讨会（2023年1月7-8日 腾讯会议）欢迎加入“逻辑神经科学”【1】“ 逻辑神经科学 ”诚聘编辑/运营岗位 ( 在线办公)【2】“ 逻辑神经科学 ”诚聘副主编/编辑/运营岗位 ( 在线办公)【3】人才招聘︱“ 逻辑神经科学 ”诚聘文章解读/撰写岗位 ( 网络兼职, 在线办公)
参考文献（上下滑动阅读）

[1] John B, Bellipady S S, Bhat S U. Sleep Promotion Program for Improving Sleep Behaviors in Adolescents: A Randomized Controlled Pilot Study. Scientifica (Cairo), 2016, 2016(8013431.[2] Scammell T E, Arrigoni E, Lipton J O. Neural Circuitry of Wakefulness and Sleep. Neuron, 2017, 93(4): 747-765.[3] Bringmann H. Sleep-Active Neurons: Conserved Motors of Sleep. Genetics, 2018, 208(4): 1279-1289.[4] Herice C, Sakata S. Pathway-Dependent Regulation of Sleep Dynamics in a Network Model of the Sleep-Wake Cycle. Front Neurosci, 2019, 13(1380.[5] Liu D, Dan Y. A Motor Theory of Sleep-Wake Control: Arousal-Action Circuit. Annu Rev Neurosci, 2019, 42(27-46.[6] Bausenwein B, Muller N R, Heisenberg M. Behavior-dependent activity labeling in the central complex of Drosophila during controlled visual stimulation. J Comp Neurol, 1994, 340(2): 255-268.[7] Lebestky T, Chang J S, Dankert H, et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron, 2009, 64(4): 522-536.[8] Ofstad T A, Zuker C S, Reiser M B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature, 2011, 474(7350): 204-207.[9] Seelig J D, Jayaraman V. Neural dynamics for landmark orientation and angular path integration. Nature, 2015, 521(7551): 186-191.[10] Fisher Y E, Lu J, D'alessandro I, et al. Sensorimotor experience remaps visual input to a heading-direction network. Nature, 2019, 576(7785): 121-125.[11] Kim S S, Hermundstad A M, Romani S, et al. Generation of stable heading representations in diverse visual scenes. Nature, 2019, 576(7785): 126-131.[12] Kottler B, Faville R, Bridi J C, et al. Inverse Control of Turning Behavior by Dopamine D1 Receptor Signaling in Columnar and Ring Neurons of the Central Complex in Drosophila. Curr Biol, 2019, 29(4): 567-577 e566.[13] Hulse B K, Haberkern H, Franconville R, et al. A connectome of the Drosophila central complex reveals network motifs suitable for flexible navigation and context-dependent action selection. Elife, 2021, 10([14] Shiozaki H M, Kazama H. Parallel encoding of recent visual experience and self-motion during navigation in Drosophila. Nat Neurosci, 2017, 20(10): 1395-1403.[15] Hardcastle B J, Omoto J J, Kandimalla P, et al. A visual pathway for skylight polarization processing in Drosophila. Elife, 2021, 10([16] Liu S, Liu Q, Tabuchi M, et al. Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit. Cell, 2016, 165(6): 1347-1360.[17] Liu C, Meng Z, Wiggin T D, et al. A Serotonin-Modulated Circuit Controls Sleep Architecture to Regulate Cognitive Function Independent of Total Sleep in Drosophila. Curr Biol, 2019, 29(21): 3635-3646 e3635.[18] Aleman A, Omoto J J, Singh P, et al. Opposing subclasses of <em>Drosophila</em> ellipsoid body neurons promote and suppress sleep. bioRxiv, 2021, 2021.2010.2019.464469.[19] Hamada F N, Rosenzweig M, Kang K, et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature, 2008, 454(7201): 217-220.[20] Wiggin T D, Goodwin P R, Donelson N C, et al. Covert sleep-related biological processes are revealed by probabilistic analysis in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A, 2020, 117(18): 10024-10034.

本文完